石松
- 作品数：7 被引量：5H指数：2
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- 一种细菌RNase E截短体及其应用
- 本发明公开了一种细菌RNase E截短体及其应用，细菌RNase E截短体的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，本发明利用RNase E的N端(氨基酸残基1～529)可降解RNA的功能域，体外合成该截短体(REt)的核...
- 孙达权石静余畅陈相屹石松徐莹莹胡桐张钦真
- 文献传递
- 人Spsb1基因慢病毒干扰载体的构建及病毒包装
- 2017年
- 目的:构建人Spsb1基因的shRNA慢病毒干扰载体,为研究该基因在肝癌细胞生长、增殖、转移和浸润中的作用打下前期基础。方法:根据shRNA的设计原则设计一段shRNA和阴性对照shRNA,化学合成DNA双链中的两条单链,通过退火和配对后与慢病毒干扰载体LV-3(p GLVH1/GFP+Puro)连接,阳性克隆子LV3-Spsb1测序鉴定;将LV3-Spsb1和辅助质粒p CMV-delta8.91/p CMV-VSVG共转染HEK293T细胞,转染后24 h在荧光显微镜下观察细胞转染效率;用转染后收集到的病毒液感染肝癌细胞SMMC-7721,荧光显微镜下观察细胞荧光;用1 mg/L嘌呤霉素杀死未感染的细胞,Western blot检测细胞内源性Spsb1基因表达量。结果:测序鉴定证明获得的LV3-Spsb1质粒是所需要的目的慢病毒shRNA干扰载体;通过与辅助质粒共转染HEK293T细胞后,细胞在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,提示细胞转染效率较高;病毒液感染SMMC-7721后,细胞内出现绿色荧光,证明共转染系统可以成功包装shRNA-Spsb1重组慢病毒颗粒;Western blot结果显示shRNA-Spsb1重组慢病毒能够抑制细胞内Spsb1基因表达,证明shRNA-Spsb1的确可以降低肝癌细胞内源性Spsb1基因表达,可用于后期的基因功能研究。结论:成功构建人Spsb1基因的慢病毒shRNA干扰载体LV3-Spsb1并包装出其慢病毒颗粒。
- 孙达权石松徐莹莹雷霆雯莫晓川王筑婷李红梅徐国强
- 关键词：肝肿瘤脂质体转染
- 核不均一核糖核蛋白C2基因克隆及其对肝癌细胞生长的影响被引量：1
- 2017年
- 目的:探讨人核不均一核糖核蛋白C2(RNPC2)基因在肝癌细胞生长增殖中的作用。方法:采用RTPCR方法扩增肝癌细胞SMMC-7721 RNA中RNPC2基因编码区的目的片段,构建真核表达载体p EGFP-RNPC2并进行细胞转染;采用G418抗生素筛选稳转细胞,SDS-PAGE和Western blot法测定稳转细胞内RNPC2蛋白表达,CCK-8法测定稳转细胞的增殖能力。结果:从培养的肝癌细胞SMMC-7721中抽提总RNA并反转录成c DNA,通过RNPC特异性引物扩增出RNPC2基因;测序鉴定获得双酶切分离纯化目的片段后,插入真核表达载体p EGFP-C1中,成功构建真核表达载体p EGFP-RNPC2;通过细胞稳定转染、G418药物筛选和荧光显微术获得表达外源融合蛋白GFP-RNPC2的稳转细胞株,并用Western blot验证及CCK-8分析证明GFP-RNPC2稳转细胞的生长增殖速率增加。结论:RNPC2可以促进肝癌细胞生长增殖。
- 孙达权石松徐莹莹雷霆雯莫晓川王筑婷李红梅徐国强
- 关键词：细胞真核表达脂质体转染
- 一种细菌RNase E截短体及其应用
- 本发明公开了一种细菌RNase E截短体及其应用，细菌RNase E截短体的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，本发明利用RNase E的N端(氨基酸残基1～529)可降解RNA的功能域，体外合成该截短体(REt)的核...
- 孙达权石静余畅陈相屹石松徐莹莹胡桐张钦真
- 文献传递
- 一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用
- 本发明公开了一种细菌源性的抗肿瘤PNPase基因及其制备方法与应用，抗肿瘤PNPase基因为PNPase基因序列3'末端添加SV40核定位信号序列的核苷酸片段，抗肿瘤PNPase基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示...
- 孙达权石静徐国强薛殿婷石松余畅何淼
- 文献传递
- HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装被引量：2
- 2017年
- 目的构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3’UTR RNA与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础。方法根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达。结果经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体。通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光。嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达。结论成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株。
- 孙达权罗福丽廖美石松薛殿婷徐莹莹秦龙燕徐国强
- 关键词：RNAI脂质体转染肝癌细胞
- HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达被引量：2
- 2018年
- 目的:克隆人抗原R基因(HuR)的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。
- 张凯琳汪书华石松饶敏孙达权
- 关键词：肝癌细胞脂质体转染真核表达
